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THLE-2 人正常肝細(xì)胞傳代/復(fù)蘇技巧
點(diǎn)擊次數(shù):319 更新時(shí)間:2024-01-12

THLE-2 人正常肝細(xì)胞

,THLE2

貨號(hào):YJ-h388(STR鑒定)

價(jià)格: 3000.0

規(guī)格: 1*10 6 

細(xì)胞介紹

THLE-2 是從供體左葉分離的上皮細(xì)胞,TTHLE-2 ( ATCC CRL-2706和 THLE-3 ( ATCC CRL-11233 ) 細(xì)胞系是通過(guò)感染 SV40 大 T 抗原從原代正常肝細(xì)胞中獲得的。[RF84749] 該病毒是通過(guò)引入含有將SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段導(dǎo)入兩性包裝細(xì)胞系PA317。[RF84750] THLE-2 和 THLE-3 細(xì)胞表達(dá)正常成人肝上皮細(xì)胞的表型特征。當(dāng)注射到無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)時(shí),它們不會(huì)產(chǎn)生腫瘤,具有接近二倍體的核型,并且不表達(dá)甲胎蛋白。[RF84750] THLE-2 和 THLE-3 細(xì)胞將苯并[a]芘、N-亞硝基二甲胺和黃曲霉毒素 B1 代謝為其最終致癌代謝物,這些代謝物會(huì)加合 DNA,這表明功能性細(xì)胞色素 P450 途徑。[RF84750] 其他參與化學(xué)致癌物代謝的酶,例如環(huán)氧化物水解酶、NADPH 細(xì)胞色素 P450 還原酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶也被 THLE 細(xì)胞保留。

細(xì)胞特性

1) 來(lái)源:肝; 左葉

2) 形態(tài):上皮細(xì)胞樣,貼壁生長(zhǎng)

3) 含量:>1x106  細(xì)胞數(shù)

4) 規(guī)格:T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途:僅供科研使用。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

1)1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2)T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨,收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1)收到細(xì)胞后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染,請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2)請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照(10×,20×)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3)貼壁細(xì)胞:細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況,有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下,可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基(若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,重懸打入到原培養(yǎng)瓶中),加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL,放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上,可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中,若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4)備注:運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1:2傳代 。 

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:

1)準(zhǔn)備BEGM kit培養(yǎng)基  (Lonza/Clonetics,CC-3170)備注:培養(yǎng)基包含(A+B),ATCC 不使用 BEGM 試劑盒提供的 GA(慶大霉素-兩性霉素 B 混合物) 和腎上腺素(Epinephrine),另向其中添加額外的 5 ng/mL  EGF、70 ng/mL 磷酸乙醇胺 10% FBS。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求添加P/S雙抗,1%。

A: BEBM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基  (貨號(hào)CC-3171)       500ML

B:  細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑    (貨號(hào)CC-4175)        一套(包含下列試劑)

● BPE, 2.0 ml ● Hydrocortisone, 0.5 ml    ● hEGF, 0.5 ml

● Epinephrine, 0.5ml  ● Insulin,0.5 ml      ● Transferrin, 0.5 ml

● Triiodothyronine, 0.5 ml ● Retinoic Acid, 0.5 ml ● GA, 0.5ml

注意: The flasks used should be precoated with a mixture of 0.01 mg/mL fibronectin, 0.03 mg/mL bovine collagen type I and 0.01 mg/mL bovine serum albumin dissolved in BEBM medium.

該細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)周期2-3周左右。

2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3)凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。

二.細(xì)胞處理:

1) 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(或皿)中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2) 細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法:

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘(難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間),然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。 

3.輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說(shuō)明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3)細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

THLE-2 人正常肝細(xì)胞.png


下面T25瓶為例;

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中,可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ,按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中,標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,-80度冰箱中過(guò)夜,之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)

1.收到細(xì)胞后,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋,瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)(視細(xì)胞密度而定)穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片,觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況,隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài),100*,200*各一張),觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?,故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài),故客戶需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題后客服人員溝通的時(shí)間證明,期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作,并請(qǐng)注意防護(hù),所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

5.客戶在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,有技術(shù)問(wèn)題可以聯(lián)系咨詢技術(shù)售后,我們隨時(shí)給予解答。

 

2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及論文潤(rùn)色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤(rùn)色十多年,是您值得信賴的科研合作伙伴!

如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無(wú)法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

 

實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù):

 


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